血清總蛋白質(zhì)測(cè)定方法介紹 1、凱氏定氮法仍然是建立各個(gè)具體方法時(shí)采用的參考標(biāo)準(zhǔn)方法。 2、雙縮脲比色法是目前首先推薦的蛋白質(zhì)定量方法。方法操作簡(jiǎn)便，雖然雙縮脲試劑有大同不異。其中酒石酸鉀納可以穩(wěn)定在堿性溶液中的銅離子，含有碘化物作為抗氧化劑。雙縮脲反應(yīng)生成的復(fù)合物其吸收峰為540nm。可采用*的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)稱(chēng)量，必要時(shí)用凱氏定氮法標(biāo)定。各地質(zhì)控中心提供的混合標(biāo)準(zhǔn)血清可作為第二參考，血清用量100μl，在10-120g/L濃度范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，批內(nèi)CV值<2% 3、染料結(jié)合法 蛋白質(zhì)可與某些染料特異結(jié)合，如氨基黑與考馬亮藍(lán)。這一性質(zhì)除了可以用于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶染色，亦可用于總蛋白質(zhì)的定量。缺點(diǎn)是多種蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合力不一致。考馬亮藍(lán)在與蛋白質(zhì)結(jié)合后的吸收峰從465nm移向595nm，這一性質(zhì)可用分光光度法來(lái)定量檢測(cè)。 4、采用沉淀反應(yīng)進(jìn)行散射比濁法 用磺柳酸、三氯醋酸等配方，此方法甚為簡(jiǎn)便，不需特殊儀器，技術(shù)關(guān)鍵在于：①選擇*試劑濃度及溫度；②混勻技術(shù)；③選用的標(biāo)準(zhǔn)；④待測(cè)標(biāo)本中的蛋白濃度。 5、采用280nm和215/225紫外吸收值，計(jì)算蛋白質(zhì)含量 280nm 是由于蛋白質(zhì)分子中存在芳香族氨基酸所致。方法的特異性和準(zhǔn)確性受蛋白分子中該種氨基酸的含量比例影響甚大。尿酸和肝紅素在280nm附近有干擾。紫外區(qū)200-225nm是肽健的強(qiáng)吸收峰。在此區(qū)域其吸收值為280nm的10-30倍，將血清稀釋1000-2000倍可以消除干擾物質(zhì)的影響。 6、基于蛋白分子中含有酪氨酸和色氨酸而使用的酚試劑比色法由于各種蛋白質(zhì)分子中上述兩種氨基酸的組成比例不同，特別是白蛋白含色氨酸為0.2%，而γ-球蛋白中含量達(dá)2%-3%，導(dǎo)致較大的差異。Lowry的改良法在酚試劑中加入Cu2++，集中原法和雙縮脲反應(yīng)兩者的作用，使呈色靈敏度提高。其中75%的呈色依賴(lài)于Cu2++。反應(yīng)產(chǎn)物*吸收峰在650-750nm，方法靈敏度為雙縮脲方法的100倍左右。有利于檢測(cè)較微量的蛋白質(zhì)。但試劑反應(yīng)仍易受多種化合物的干擾。 7、染料結(jié)合法 蛋白質(zhì)可與某些染料特異結(jié)合，如氨基黑與考馬亮藍(lán)。這一性質(zhì)除了可以用于電泳后的蛋白質(zhì)區(qū)帶染色，亦可用于總蛋白質(zhì)的定量。缺點(diǎn)是多種蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合力不一致。考馬亮藍(lán)在與蛋白質(zhì)結(jié)合后的吸收峰從465nm移向595nm，這一性質(zhì)可用分光光度法來(lái)定量檢測(cè)。 |
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