研制針對特殊細胞系或原代培養的無血清培養基主要有兩種方法。*種方法是找到一個相關細胞類型的培養基已知配方，加入或不加。10％一20％的透析血清，在減少血清的同時．逐一或成組的改變培養基成分直到培養基達到所需的條件。這種方法zui初由Ham及其同事采用，通常能提供培養條件。如果發現一組成分在血清減少時起到補充的作用，那就通過單種成分的逐步逐一刪除將活性成分從中篩選出來，然后尋找其濃度。 由于*種方法耗費時間長，使人們想到了第二種方法，即對現有培養基，如RPMI1640或DMEM與Ham’s F12的聯合培養基加以補充，而且將加入成分的種類限制在一個較小的范圍內，僅包括硒、轉鐵蛋白、白蛋白、胰島素、雌激素、三碘甲狀腺原氨酸、乙醇胺、磷酸乙醇胺、生長因子(EGF、FGF、PDGF、內皮生長添加物等)、前列腺素(PGE1、PGF2a)和其他有特殊功能的物質。通常對多數細胞而言，硒、轉鐵蛋白、胰島素都很重要，但對其他成分的需求則差別較大。 1)無血清培養基的制備 使用無血清培養的時間還不長，*通用的無血清培養基還處在研究階段，然而已開始有商品供選擇，如MCDB、Ultroser系列無血清培養基等。 以Ultroser G為例，它包括有生長因子、附著因子、微量元素、激素、連接素、維生素6種物質；此外還含有抑制胰蛋白酶因子，便于用胰蛋白酶傳代。ultroser G為凍干制品，溶解后可用微孔濾膜過濾除菌，儲存于4℃；它的刺激生長作用相當于胎牛血清的5倍。 其他類型的無血清培養基在不斷問世。如MEM Iscow!也是一種較好的粉劑無血清培養基，在MEM的基礎上外加有轉鐵白蛋白、牛血清蛋白和黃豆脂質(Soybean Lipids)。毫無疑問，無血清培養基有很大的實用價值，而且是可行的，一定會得到更進一步的發展。 但由于當前缺少廣泛使用的定型無血清產品，在所需附加物有限的情況下，也可自行配制無血清培養基。培養用的細胞外基質(EcM)有時可以直接加入培養基內，但更常用的是使ECM貼附在細胞生長底物表面，生長表面用玻璃或是無毒的塑料材料均可。配制時要用超純的試劑和水，小心配制含Ca 2+ 、Fe 2+或Fe 3+的溶液，防止產生沉淀。在堿性pH條件和有磷酸鹽存在的時候，金屬鹽溶液會產生沉淀，特別是在培養基或鹽溶液經過高壓滅菌后更易產生，所以儲存液中的陽離子必須保存在低pH條件下(低于6．5)，并且保證無磷酸鹽的存在。溶液必須經過高壓滅菌或過濾消毒。通常的方法是I臨用培養基之前再加陽離子，或者將各種組分配制成一系列的儲存液，如：1 000x的礦物質和維生素，50x的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸溶解于0．1 mol／L HCl中，100x的必需氨基酸溶解于水中，lOx的鹽溶解于水中，還有其他的特殊輔助因子、脂類等配制成1 000X溶液。這些成分要按照正確的比例配制并稀釋到zui終的濃度，然后檢測pH和滲透壓。 制備過程要在嚴格無菌條件下進行，具體制備程序如下： ①選擇適宜的培養細胞外基質(ECM)，按上述條件先配制儲存母液。 ②使用前，儲存母液用高純度的蒸餾水稀釋成O．1 mg／mL濃度的使用液。 ③使用液用0．22 μm孔徑的微孔濾膜過濾除菌。 ④用吸管吸取使用液，均勻涂于消毒滅菌的細胞培養器皿的細胞生長表面。使用液的用量可按每cm2表面加50止的溶液，為保證其表面全部被溶液浸濕，用量可適當增減。 ⑤室溫下靜置5 min(使用膠原做基質時，可適當延長時間至24 h)，然后吸出多余的溶液。 ⑥用滅菌蒸餾水(100μL／cm2)洗滌涂有ECM的表面，然后將水分盡量吸凈控干。 ⑦根據不同細胞生長特點，接種適宜濃度的細胞進行培養。 |
