(一)常用細胞轉化實驗 常用人工誘發細胞轉化實驗包括物理、化學和病毒誘導三種，下面介紹化學致癌物和病毒細胞轉化兩個實驗。 l.化學致癌物誘導細胞轉化實驗 (1)原理：化學致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化學物質引起或誘導正常細胞發生惡性轉化并發展成腫瘤的過程。通過細胞表型的改變，反映各種理化因素的致癌性，同時，可模擬化學致癌物在體內致癌的過程，并可對發生轉化的細胞做直接觀察和各種分析。其中以敘利亞地鼠胚胎初代培養細胞較為常用，現在以N一甲基一N'一硝基一N一亞硝基胍(MNNG)進行細胞轉化實驗為例。 (2)材料 1)動物：鼠(如：敘利亞地鼠，金倉鼠等)。 2)細胞生長液：含20％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養液。 3)維持液：含5％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養液。 4)消化液：O．25％胰蛋白酶(含O．01％EDTA)。 5)凍存液：含lO％小牛血清的DMSO。 6)致癌劑：MNNG。 7)洗液：PBS。 (3)方法 1)取材：妊娠第13天鼠，取數個同窩胚胎，去頭和內臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0．25％胰蛋白酶(含O．Ol％EDTA)37℃消化30min，濾過，低速離心，吸除消化液，加入營養液制備成細胞懸液，接種人75cm培養瓶中，接種密度為10～20×106／75 cm，37℃培養2～3d。 2)貯存：選大批生長狀態良好的細胞凍存。 3)致癌物處理：取凍存細胞，解凍后接種于25ml培養瓶中，每瓶含細胞10萬～30萬。待細胞生長進入指數增生期時，加入含0．5～1．Omg／L MNNG的*培養基，在37℃孵箱中培養12～48h。 4)低血清培養：棄掉MNNG致突變劑，用溫PBS洗2～3次，加入含20％小牛血清，繼續置溫箱中培養2～3周，然后改用含5％血清培養液培養。低血清培養液不利于正常細胞牛長，但已轉化的細胞仍能增殖和形成轉化灶。 5)轉化灶的形成：用致癌物處理過的細胞于10d后在正常細胞之間，可產生數量不等的轉化灶。轉化灶由密集而重疊的細胞組成。在透光檢查時，肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉化灶。顯微鏡下觀察，未轉化的成纖維細胞轉化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性，失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉化灶邊緣，轉化細胞與正常細胞界限分明，形態區別相當明顯。上皮細胞轉化后形態變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。 6)轉化細胞的分離：將培養瓶放在倒置顯微鏡下觀察轉化細胞，將轉化灶用記號筆標記。用細胞刮去除未發生轉化的外圈正常細胞。向瓶內加入PBS清洗3次，再加入消化液．37℃下消化數分鐘。鏡下觀察細胞變圓時，加人含10%小牛血清的*培養液，反復用吸管吹打分散，制成細胞懸液，分瓶培養。成單層后，再用傳代法擴大培養。 (4)轉化細胞觀察與鑒定：轉化灶由密集而重疊的細胞組成。肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉化灶。顯微鏡下觀察，成纖維細胞轉化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性．失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉化灶邊緣，轉化細胞與正常細胞界限分明，形態區別明顯。上皮細胞轉化后形態變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。 2．病毒轉化細胞實驗 (1)原理：很多病毒都有轉化細胞的作用，尤以致癌病毒zui為明顯。EB病毒(EBV)是近年來常用于轉化細胞的病毒。該病毒對人二倍體細胞的轉化效果，常用于建立淋巴細胞永生細胞系。人外周血B淋巴細胞膜上有。EB病毒受體，當EB病毒與受體結合后，B淋巴細胞可發生轉化，成為體外長期傳代生長的細胞系。 (2)材料 1)病毒：EB病毒液(取自培養的B95—8細胞)。 2)轉化細胞：檸檬酸或肝素抗凝人外周血。 3)細胞培養液：含20％胎牛血清的RPMI 1640。 4)抗生素：青霉素、鏈霉素和慶大霉素。 5)洗液：PBS。 (3)方法 1)血液制備：抗凝全血1～2ml，分裝于15ml離心管中，每管O．5ml，置于4℃冰箱中放置30min后，加入不含血清的RPMI1640離心洗一次，用含20％胎牛血清的細胞培養液制成細胞懸液。 2)EB病毒的獲得：培養的B95—8細胞，10000r／min離心15min去除細胞碎片，再經24000r／min，離心90min獲得病毒沉淀，以1：100體積培養液溶解獲得EB病毒濃縮液。 3)EB病毒轉化：加入EB病毒液，O．3～0．5ml／管，37℃水浴30min～2h，并不時搖動，以利于病毒吸附和并防止血凝塊產生。 4)分裝入50ml培養瓶中，同時補加培養液，5ml／管，置入含5％CO2的37℃溫箱中培養。 5)細胞培養一周后再補入2ml培養基。 6)每3～4d加液或半量換液，隨細胞數量增多，可分裝人大瓶中培養。為了提高轉化效率，常將全血凍存復蘇后采用。 (4)結果觀察與鑒定：需每天鏡檢培養物，開始培養時，鏡下可見大量紅細胞，難以觀察到單核細胞。培養5～7d后，單個或成團的淋巴細胞增殖迅速，成大團塊，呈懸浮生長，紅細胞已*消失，轉化完成。 |
