細(xì)胞凋亡時(shí)，染色體雙鏈DNA裂解產(chǎn)生的核小體DNA可以與核心組蛋白H2A、H2B、H3、H4結(jié)合形成復(fù)合物，保護(hù)其DNA不被核酸酶降解。在細(xì)胞凋亡的早期，只有少數(shù)細(xì)胞的DNA發(fā)生斷裂，用生化法很難通過凝膠電泳方法檢測出DNA梯度。使用抗組蛋白和抗DNA的單克隆抗體ELISA法檢測凋亡細(xì)胞，不僅可以提高了檢測的靈敏度，還可以在早期檢測細(xì)胞凋亡。 (一)材料 1．待檢細(xì)胞HL一60細(xì)胞(髓性白血病細(xì)胞株，ATCC：CCL240)105／ml。 2．試劑 (1)包被液(臨用前配制)：①O．1mol／L PBS(pH9．2)：Na2C03 1．36g、NaHCO 3 7.35g、雙蒸水950ml．可用1mol／LHCl或1mol／LNaOH調(diào)pH至9．2，加雙蒸水定容至1000ml。②抗組蛋白抗體：取適量抗體凍干粉，加lml雙蒸水充分溶解，取1pl抗組蛋白抗體，加9μl 0．1mol／L碳酸鹽緩沖液(pH9．2)。 (2)PBS(pH7．3)：①10×貯存液：NaCl 80g、KCI 2g、Na2HP04·7H20 11．5g、KH2PO4 2g，溶于1000ml雙蒸水中。②l×工作液；以雙蒸水lO倍稀釋貯存液。 (3)裂解液：10mmol／L Tris—HCl(pH 8．O)、10mmol／L NaCl、10mmol／L EDTA、100mg／ml蛋白酶K、1％SDS。 (4)封閉緩沖液：0．05％Tween一20、1 mmol／L EDTA、0．25%BSA或5％脫脂奶粉、0.05％疊氮鈉(NaN3)。 (5)洗滌緩沖液(含0．05％NaN3的PBS)：取NaN3 0．5g，溶于1000ml PBS緩沖液中。 (6)酶聯(lián)抗體工作液(臨用前配制)：取適量辣根過氧化物酶(horseradish peroxides，HRP)標(biāo)記的抗DNA凍干粉，溶于1ml雙蒸水中，取lμl HRP一抗DNA抗體與9μl封閉緩沖液混勻。 (7)底物緩沖液(DAB—H2O2)：取50～75mg DAB，溶于100ml 0．05 mol／L Tris～HCl(DH7．4)中，室溫下在暗處振蕩溶解，用濾紙過濾后，4℃暗處保存，臨用前加0．01％～0．003％H2O2。 (8)喜樹堿溶液(1μg／ml、2μg／ml、4μg／ml)：稱量400μg喜樹堿(camptotheein)，溶于培養(yǎng)液(4μg／m1)中。再用培養(yǎng)液分別稀釋2倍(2μg／ml)和4倍(1μg／ml)。 3．器具酶標(biāo)微孔板(96孔或48 孔)、酶標(biāo)分析儀、平臺振蕩儀、低溫離心機(jī)。 (二)方法 1．抗組蛋白抗體包被酶標(biāo)板，每孔加人包被緩沖液lOOμl，室溫下包被1小時(shí)，或4℃包被過夜。甩去包被液，每孔加入細(xì)胞裂解緩沖液200μ1，置于室溫下30min。甩去裂解緩沖液，每孔加入封閉緩沖液200μl．室溫下封閉30min。 2．甩去封閉緩沖液，每孔加洗滌緩沖液250μl，靜置30s，甩干。如此反復(fù)洗板3次。 3．取指數(shù)生長期的HL一60細(xì)胞，用培養(yǎng)液稀釋至105／ml。各取500μl(5×104個(gè))細(xì)胞，加入4個(gè)Eppendorf管內(nèi)。 4．于3個(gè)管中分別加入含有凋亡誘導(dǎo)劑喜樹堿1μg／ml、2μg／ml和4μg／ml的培養(yǎng)液500μl，另一管僅加培養(yǎng)液500μl作為陰性對照，置37℃、5%CO2孵箱中孵育4h。 5．置臺式離心機(jī)上，1500r／min(或2000g)離心5min，去上清液，加入lml培養(yǎng)液再懸浮細(xì)胞，同法再離心一次，將細(xì)胞再懸浮于lml細(xì)胞裂解液中，4℃作用30min。 6．置臺式低溫超速離心機(jī)上，1500r／min離心10min。小心吸出400μl上清液于小試管中，與3．6ml細(xì)胞裂解液混合(1：10稀釋，lml中相當(dāng)有104個(gè)細(xì)胞)，立即用于核小體的酶標(biāo)測定，或于一20℃凍存，待樣品集中到一定數(shù)目時(shí)再測定。 7．在包被抗組蛋白抗體的酶標(biāo)板上，于每孔加待測樣品(不同量凋亡誘導(dǎo)劑作用管及對照管)溶液100μl，每樣品平行作2孔，另設(shè)2孔只加細(xì)胞裂解緩沖液，作為測定本底的空白對照，室溫下孵育90min。 8．甩去反應(yīng)液，如上述步驟2法洗板后，每孔加HPR一抗DNA抗體100μl(空白對照孔不加)，室溫下孵育90min。 9．甩去酶標(biāo)抗體，如上述步驟2法洗板后，每孔加DAB—H2O2底物緩沖液lOOμl，置室溫下暗處反應(yīng)lO~20min。以底物緩沖液為對照，在酶標(biāo)檢測儀上于波長405nm處測定各孔OD值。如果樣品孔OD值超過了儀器測量范圍，則將樣品適當(dāng)稀釋后再測定。 (三)結(jié)果 待檢測樣品OD值等于從3個(gè)待檢測樣品平行7L的OD值減去本底OD值。它代表正在死亡和已經(jīng)死亡的細(xì)胞數(shù)目。凋亡細(xì)胞以富集系數(shù)(enrichment factor，EF)表示，EF值的高低代表稀釋到胞質(zhì)中的核小體單體或寡聚物的多少，等于待測樣品OD值除以陰性對照孔的OD值。 在一般條件下，加人底物反應(yīng)15min后，本底OD值應(yīng)小于樣品OD值的1／lO。嚴(yán)格控制培養(yǎng)細(xì)胞中的死細(xì)胞數(shù)目很重要。通常在指數(shù)生長期的培養(yǎng)細(xì)胞中有3％～8％的死細(xì)胞，這些死細(xì)胞會使OD值增加。 |
