在構建重組表達體系時，當目的基因和載體重組并導人宿主后，并非能全部按照預先設計的方式重組和表達，由于各種副反應的存在、重組DNA導人宿主的低效率、操作的失誤及其他不可預測因素的干擾，真正獲得目的基因并能有效表達的重組子只是一小部分，而絕大部分仍是原來的受體細胞，或者是不舍目的基因的克隆。為了從處理后的大量受體細胞中分離出真正所需的重組子，需要采用一系列篩選和鑒定的方法。 1.耐藥性基因篩選法 篩選重組菌的具體方法因所采用的載體一宿主系統的不同而不同。很多細菌表達系統的載體一般帶有抗生素抗性篩選標記，如四環素抗性基因(tetr)、氨芐西林抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kanr)等。當編碼有這些耐藥性基因的質粒攜帶目的DNA進入宿主細胞后，便可使重組細胞在含這些抗生素的培養基中生長。由于要篩選的是含目的DNA的重組菌，為了區分含重組質粒的克隆和含空質粒的克隆，可以采用插人失活檢測法。這種方法是將目的DNA插入到載體的某個抗性基因之中．使該抗性基因失活，這樣含重組質粒的克隆便不能在含這一抗生素的培養基中存活，而含空質粒的克隆則能存活。例如前面介紹的pBR322質粒上有兩個抗生素抗性基因，抗氨芐西林基因(ampr)上有單一的Pst I位點，抗四環素基因(tetr)上有SalI和BamHI位點。當外源DNA片段插入到SalI／Bam H I位點時，使抗四環素基因失活，這時含有重組體的菌株從amprtetr變為amp r tet s。這樣，凡是在含氨芐西林的平板上能生長，而在同時含氨芐西林和四環素的平板上不能生長的菌落就可能是所要的重組體。 利用耐藥性基因進行篩選的另一方法是直接篩選法。由于在一種質粒上往往具有兩種耐藥性基因，用插入失活檢測法時要在分別含兩種抗生素的平板上進行篩選。為了做到在一個平板上直接篩選，可將插入缺失重組后轉化的宿主細胞培養在含四環素和環絲氨酸的培養基中，重組體馴。生長受到抑制，非重組體tet s雖能使細胞生長，但因環絲氨酸可在蛋白質合成時摻人而導致細胞死亡。重組體tet s因僅僅是受抑制，故接種到另一培養基中時便可重新生長。 2. a-互補法 這是目前經常使用的重組子篩選方法。許多載體都帶有一個大腸桿菌爭半乳糖苷酶基因(lacz)的調控序列和前146個氨基酸等蛋白質N端部分序列。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS)。它并不破壞β-半乳糖苷酶N端的功能。在一些大腸桿菌宿主菌中，染色體上含有編碼口一半乳糖苷酶C端部分序列的基因，可以表達出口一半乳糖苷酶的C端蛋白質。當宿主和質粒上的lacZ基因片段單獨存在時，分別表達出的蛋白質產物不具有 β-半乳糖苷酶活性。但它們同時存在時，這些蛋白質司表現出酶活性，買現J宿王細胞和質粒上分別攜帶的lacZ基岡片段的功能互補，稱為a一互補。由a一互補而產生的大腸桿菌細胞在誘導劑IPTG的作用下，β-半乳糖苷酶催化X—gal變為藍色，從而產生藍色菌落，因而易于識別。然而，當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后，破壞了質粒上的lacZ基因片段，不能表達出正確的N端蛋白質，從而不能進行a一互補，使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。因此，這種重組子的篩選，又稱為藍白斑篩選。 3.營養缺陷型篩選法 還有一些表達體系采用的是營養缺陷型篩選標記，如一些酵母表達體系等。這樣的體系中，宿主細胞為營養缺陷型，不能在基本培養基上生長，而載體含有該缺陷型所缺失的基因．因此重組子可以在基本培養基上生長。這樣，采用基本培養基就可起到選擇的效果。 通過上述方法篩選后，可以排除大量的未經重組的宿主細胞。但是，這還不能保證剩余的細胞中目的基因全部按照預先設計的方式重組和表達。因此，zui后還需要通過直接檢測表達產物的方法加以鑒定。如果目的基因的編碼產物是酶，可以通過測定酶活力定量地確定表達水平。如果基因的編碼產物不具有已知的催化活性，則可采用蛋白質電泳、酶聯免疫等方法定性、定量地測定表達產物。 |
