綠色熒光蛋白GFP、黃色熒光蛋白YFP等一系列熒光蛋白為研究細胞內蛋白質的定位提供了*的標記物。通過構建融合蛋白的方法使之能夠標記過表達的目的蛋白，可以反映蛋白的亞細胞定位。在轉染中，將兩種甚至多種過表達融合蛋白的質粒轉染到同一細胞中，就可以通過分析不同熒光蛋白的信號來了解不同蛋白在細胞中的共定位情況（SambrokandRusel 2001）。構建融合蛋白的過程中，可以將熒光蛋白融合到蛋白質的N端或者C端，因為熒光蛋白基團可能會封閉蛋白質的N端或者 C端對蛋白質定位的影響。在研究中，推薦大家使用Clontech公司的pEGFP（綠色熒光基團）和 dsRED（紅色熒光基團）系列載體，它們分別提供了N端和C端兩種不同的融合方式以及3個閱讀框的選擇。其中N載體將熒光蛋白融合在C端暴露蛋白N端，而C載體將熒光蛋白融合在N端暴露蛋白C端。在構建克隆的過程中，建議同時構建N端和C端兩種融合方式的重組質粒來進行下一步的實驗。 有條件的話（如果手上有GFP等熒光基團的相應抗體）建議先使用用Western檢測質粒融合表達的效果。以下實驗以使用12孔板（因為每孔大小正好合適作為被檢標本）作為培養容器為例。 （一）試劑材料 1.12mm圓形蓋玻片 將蓋玻片用酸液處理過夜，自來水漂洗20次，雙蒸水漂洗20次，用鑷子取出放在干燥的絲綢上晾干，干烤滅菌，這樣可以防止玻片上出現痕跡，還可以防止玻片互相粘連。 2.PBS磷酸鹽緩沖液 大家可以參考分子克隆配方配制，建議配制20×儲存液，用前稀釋。 3.4%多聚甲醛固定液 現用現配：將4g多聚甲醛 和80ml PBS混合，再加適量氫氧化鈉（調pH用）于60-80℃水浴溶解，冷卻至室溫后用氫氧化鈉調pH至7.8，之后定容至10ml，經濾紙過濾后于4℃保存。4%多聚甲醛固定液一定要認真配制，否則細胞無法正常固定，形態就無法保持。 4.雙蒸水 5.DAPI（二脒基-2-苯吲哚鹽酸）溶液 用雙蒸水將DAPI配置成2mg/ml儲存液，于-20℃避光保存，使用時用甲醇以1∶20稀釋成使用濃度1μg/ml。在我們的實驗中發現儲存時間較長的工作液會使染色背景臟，所以使用新近配制的工作液來進行染色。 6.甲醇 7.無水乙醇 8.封片劑 預先配制的2% DABCO（1，4-二氮二環［2.2.2］辛烷）/PBS制備90%的甘油。在60℃下，溶解2gDABCO（抗熒光淬滅劑）于90ml甘油中，15-30min。再加入10ml1mol/LTris-HCl，pH7.5，用 5mol/LHCl調節pH值到8.0，冷卻到室溫，再加 10ml20% thimerosal（溶解于水），4℃于棕色瓶或箔紙包裹的瓶子中避光保存。DABCO的作用是防熒光淬滅，雖然也有有很多其他的防淬滅劑可供選擇，但是DABCO應用得。如果需要使用其他的防熒光淬滅劑，則應該參照相應的說明來使用。 9.指甲油 選購無色的指甲油來進行封片，因為有的彩色指甲油中摻入的熒光物質在鏡下也能顯示熒光。也有報道說用指甲油封片可以導致 GFP信號的丟失，因為指甲油中含有乙酸乙酯/丙酮成分。碰到這種情況可以使用融化了的固體石蠟來代替。 （二）樣品處理步驟 1.將處理好的蓋玻片放在12孔板底部。如果細胞貼壁不牢（例如 HEK293）或者細胞半貼壁（例如PC12），可以用細胞刮子將鼠尾膠原均勻地涂抹在玻片上。也可使用1mg/ml多聚賴氨酸，但是效果不如鼠尾膠原。 2.將與培養基混勻后的細胞懸液加入孔中。這一步的混勻非常重要（推薦采用前后、左右“十字”形式混勻，避免渦旋），如果不勻，一般細胞都會聚集在玻片中央區域，會對形態觀察產生不利影響。分細胞的時候要注意：進行形態觀察的時候應該將細胞分得相對稀一些，密集的細胞不利于形態觀察。每孔細胞的數量根據細胞大小的不同應該作出相應調整，一般104細胞即可。 3.待大約24h后，細胞貼壁，即可進行轉染。 這一步要根據轉染試劑的轉染參考條件進行，因為細胞分得較稀，所以對于轉染試劑的毒性也會更加敏感，因而有時候有必要將轉染試劑和質粒減量。初次試驗建議轉染空載體作為陽性對照來監測轉染效率，分別設單轉染和共轉染孔來方便一種蛋白影響另一種蛋白表達時的結果分析）所以一共要設以下孔：①ProteinA-pEGFP-N1；②ProteinA-pEGFP-C1；③ProteinB-dsRED-N1；④ProteinB-dsRED-C1；⑤pEGFP；⑥dsRED。 然后根據實驗的結果，來選取合適的質粒（融合之后沒有影響蛋白的定位且表達良好）來進行共轉染。 當然，也可以和預實驗組一起進行。因為對于大部分蛋白質，N端決定了它的定位，所以使用N1載體進行實驗的情況要多一些。設這么多組合是為了確保實驗結果能反映細胞內蛋白質的真實亞定位和相互作用共定位。 4.轉染完成大于24h后即可在倒置熒光顯微鏡下觀察轉染表達效果，當出現明亮的熒光信號時就可以進行固定。（只有明亮的綠色GFP和紅色dsRED才能被認為是陽性信號，淺談的顏色一般只是本底。） 5.固定用PBS將細胞洗3遍，每遍5min。注意：如果細胞貼壁不牢（例如HEK293）或者是半貼壁細胞（例如 PC12），應該將12孔板傾斜，將PBS從低處緩緩加入，再平放，以免使細胞脫片。然后加入4%多聚甲醛固定液（如果細胞貼壁不牢，必須使用同樣的輕柔方式），室溫固定10-15min 6.用PBS將細胞洗3遍，每遍5min。方法同前。 7.用雙蒸水將細胞洗1遍，每遍5min。方法同前。 8.DAPI染核如果需要染核，在細胞上滴加 DAPI工作液。如果細胞貼壁不牢（如HEK293）或者是半貼壁細胞（例如 PC12），應該將12孔板傾斜，將PBS從低處緩緩加入，再平放，以免使細胞脫片。37℃濕盒中孵育15min。如果不需要染核，可直接進行乙醇漂洗。 9.甲醇漂洗 方法同前。 10.乙醇漂洗 方法同前。 11.用針頭將在乙醇中的玻片撬起一側，用鑷子將玻片取出放在濾紙上晾干，有細胞的一面朝上。 12.封片。 取8μl封片劑滴在載玻片上，將蓋玻片有細胞的一面朝下封片，封片劑會慢慢滲透分布于整個蓋薄片。（封片劑不能多加，否則玻片會滑動，不利于在鏡下觀察。） 13.待封片劑均勻分布于蓋玻片下，即可在周圍用指甲油封住（指甲油也只能加適量）。如果直接觀看而不需要保存較長時間，這一步可以省略。 |
