一、原理 Gus (b-glucuronidase)基因作為一種報告基因,在植物遺傳轉化研究中有廣泛的用途。Gus基因來自于大腸桿菌,編碼b-葡聚糖苷酶(一種水解酶),可催化底物5-溴-4-氯-3-吲哚葡聚糖醛酸苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-glucronide,縮寫為X-Gluc)分解,產生肉眼可見的深蘭色化合物,借此用來觀察轉基因植物中外源基因的表達情況,鑒定轉基因植株。ELISA試劑盒 二、目的 了解轉基因植物中基因表達的器官、組織和細胞的特異性,掌握Gus報告基因表達的組織化學定位的方法。 三、材料與試劑 1、轉基因植物的組織、器官、種胚或幼苗。 2、同種非轉化植物的組織、器官、種胚或幼苗。 3、50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)。 4、染色液:100mM K3[Fe(CN)6], 100mM K4[Fe(CN)6] 10mM Na2EDTA, 0.001% (v/v) triton X-100, 20%甲醇,0.5mg/ml X-Gluc, 磷酸緩沖液(50mM, pH 7.0)。 5、70%乙醇。 四、操作步驟 1、將準備好的材料沖洗干凈,用吸水紙吸干,浸在上述染色液中37℃恒溫條件下保溫過夜。 2、轉入70%乙醇中脫色2-3次,去除葉綠素,至陰性對照材料呈白色時為止。ELISA試劑盒 3、肉眼或顯微鏡下觀察,白色背景上的蘭小點即為Gus基因表達的位點。 4、83%、95%、100%乙醇中脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。 5、常規石蠟切片法切片,番紅染色。 6、顯微鏡下觀察、拍照。 五、說明 1、要設立嚴格的陰性對照,即用同樣的未轉化的材料按相同的方法同時進行染色。如陰性對照顯示蘭色,其原因可能是:A)材料和試劑被細菌感染;B)保溫時間過長。 2、染色液中的甲醇可抑制細菌生長,長時間染色可加入0.02% NaN3或100mg/ml的氯霉素,短時間染色也可以不加。 3、葉綠體含量高的材料染色后要進行脫色。ELISA試劑盒 |