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提純質(zhì)粒DNA的三個步驟
點擊次數(shù):1181 更新時間:2016-02-24

(一)細菌培養(yǎng)物的生長

    從瓊脂平板上挑取一個單菌落,接種到培養(yǎng)物中(有含有行當抗生素的液體培養(yǎng)基中生長),然后從中純化質(zhì)粒,質(zhì)粒的提純幾乎總是如此。現(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體(如pUC系列)都能復制到很高的拷貝數(shù),惟致只要將培養(yǎng)物放在標準LB 培養(yǎng)基中生長到對數(shù)晚期,就可以大量提純質(zhì)粒。此時,不必造反性地擴增質(zhì)粒DNA。然而,較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復制,所以需要在得到部分生長的細菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時,以便對質(zhì)粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成,結(jié)果阻止了細菌染色體的復制,然而,松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復制,在若干小時內(nèi),其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣,像pBR322-類的質(zhì)粒,從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同,前者大為增高。多年來,加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素μg/ml)已成為標準的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量,對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。細胞

(二)細菌的收獲和裂解

    細菌的收獲可通過離心來進行,而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種,這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個因素:質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實際,但仍可據(jù)下述一般準則來選擇適當方法,以取得滿意的結(jié)果。 

1)大質(zhì)粒(大于 15kb)容易受損,故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中,然后用溶菌酶和EDTA進生處理,破壞細胞壁和細胞外膜,再加入 SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來所需要的作用力。 

2)可用更劇烈的方法來分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后,有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑,通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對,故可使宿主的線狀染色體DNA變性,但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態(tài)而不能彼此分開。當條件恢復正常時,質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準確配置,重新形成*天然的超螺旋分子。 

3) 一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類,當隨后用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心進行質(zhì)粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類,而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時,不宜使用煮沸法。 

4)當從表達內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株,如 HB101) 中小量制備質(zhì)粒時,建議不使用煮沸法。因為煮沸不能*滅活內(nèi)切核酸酶A,以后在溫育(如用限制酶消化)時,質(zhì)粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟 (用酚:進行抽提)可以避免此問題。 

5)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高,以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產(chǎn)。然而,某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量,而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物,處理起來煞為費事,而在對數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時從較少量細胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。

(三)質(zhì)粒DNA的純化

    常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對較小及共價閉合環(huán)狀這樣兩個性質(zhì)。例如,用氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合,進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加,作為補償,將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。zui后,超螺旋度大為增加, 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限,可繼續(xù)結(jié)合更多的染料,直至達到飽和( 每2個堿基對大約結(jié)合1個溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別,線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來,氯化銫-溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費時,為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒

 

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