（一）細菌培養物的生長 從瓊脂平板上挑取一個單菌落，接種到培養物中(有含有行當抗生素的液體培養基中生長)，然后從中純化質粒，質粒的提純幾乎總是如此。現在使用的許多質粒載體（如pUC系列）都能復制到很高的拷貝數，惟致只要將培養物放在標準LB 培養基中生長到對數晚期，就可以大量提純質粒。此時，不必造反性地擴增質粒DNA。然而，較長一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復制，所以需要在得到部分生長的細菌培養物中加入氯霉素繼續培養若干小時，以便對質粒進行性擴增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質合成，結果阻止了細菌染色體的復制，然而，松弛型質粒仍可繼續復制，在若干小時內，其拷貝數持續遞增。這樣，像pBR322－類的質粒，從經氯霉素處理和未經處理的培養物中提取質粒的產量迥然不同，前者大為增高。多年來，加入足以*抑制蛋白質合成的氯霉素μg/ml)已成為標準的操作、用該方法提取的質粒DNA量，對于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務。細胞 （二）細菌的收獲和裂解 細菌的收獲可通過離心來進行，而細菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機溶劑或堿進行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個因素：質粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質粒DNA的技術。 盡管針對質粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實際，但仍可據下述一般準則來選擇適當方法，以取得滿意的結果。 1)大質粒(大于 15kb)容易受損，故應采用漫和裂解法從細胞中釋放出來。將細菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進生處理，破壞細胞壁和細胞外膜，再加入 SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細菌內部把質粒釋放出來所需要的作用力。 2)可用更劇烈的方法來分離小質粒。在加入EDTA后，有時還在加入溶菌酶后讓細菌暴露于去污劑，通過煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環質粒DNA鏈由于處于拓撲纏繞狀態而不能彼此分開。當條件恢復正常時，質粒DNA鏈迅速得到準確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。 3) 一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時可釋放相對大量的糖類，當隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進行質粒純化時它們會惹出麻煩。糖類會在梯度中緊靠超螺旋質粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區帶。因此很難避免質粒DNA內污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質粒時，不宜使用煮沸法。 4)當從表達內切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如 HB101) 中小量制備質粒時，建議不使用煮沸法。因為煮沸不能*滅活內切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時，質粒DNA會被降解。但如果通過一個附加步驟 (用酚：進行抽提)可以避免此問題。 5)目前這一代質粒的拷貝數都非常高，以致于不需要用氯霉素進行選擇性擴增就可獲得高產。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質粒DNA的產量，而是要降低細菌細胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細菌裂解物，處理起來煞為費事，而在對數中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現象。有氯霉素存在時從較少量細胞獲得的質粒DNA的量以與不加氯霉素時從較大量細胞所得到的質粒DNA的量大致相等。 (三)質粒DNA的純化 常使用的所有純化方法都利用了質粒DNA 相對較小及共價閉合環狀這樣兩個性質。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環DNA分子的結合量有所不同。 溴化乙錠通過嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結合，進而使雙螺旋解旋。由此導致線狀DNA的長度有所增加，作為補償，將在閉環質粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續結合更多的染料，直至達到飽和( 每2個堿基對大約結合1個溴化乙錠分子) 。由于染料的結合量有所差別，線狀和閉環DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質粒DNA 的方法。然而該過程既昂貴又費時，為此發展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過濾層析、分級沉淀等分離質粒DNA和宿主DNA的方法。本實驗室采用離子交換層析法已可得到*純度的質粒 |
