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ELISA試劑盒的比色

比色要注意波長(zhǎng)的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長(zhǎng)為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題。   其次，單波長(zhǎng)或雙波長(zhǎng)比色選擇的問(wèn)題。所謂的單波長(zhǎng)比色即是通常的以對(duì)顯色具有zui大吸收的波長(zhǎng)如450nm或492nm進(jìn)行比色測(cè)定；而雙波長(zhǎng)雙色則酶標(biāo)儀在敏感波長(zhǎng)如450nm和非敏感波長(zhǎng)如630nm下各測(cè)定一次，敏感波上下的吸光度測(cè)定值為樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長(zhǎng)下測(cè)定即改變波長(zhǎng)至一定值，使得樣本測(cè)定酶反應(yīng)特異顯色的吸光度值為零，此時(shí)測(cè)得的吸光度即為臟物的吸光度值。zui后酶標(biāo)儀給出的數(shù)值為敏感波長(zhǎng)下的吸光度值與非常感波長(zhǎng)下的吸光度值的差。因此，雙波長(zhǎng)比色測(cè)定具有能排除由微滴板本身、板孔內(nèi)標(biāo)本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對(duì)特異顯色測(cè)定吸光度的影響的優(yōu)點(diǎn)。由于ELISA測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值，故而在ELISA測(cè)定比色時(shí)，是使用雙波長(zhǎng)比色。    綜上所述，盡管ELISA測(cè)定的操作步驟非常簡(jiǎn)單，但有可能會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的因素卻較多，分布在測(cè)定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測(cè)定中出現(xiàn)問(wèn)題的可能原因，特對(duì)常見(jiàn)問(wèn)題及原因歸納總結(jié)于下表。   操作過(guò)程中可能出現(xiàn)的問(wèn)題和解決方法   問(wèn)題  可能原因  解決方法  顯色淡，靈敏度偏低  1、試劑盒在運(yùn)輸途中時(shí)間太長(zhǎng)，溫度太高 盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間，夏季應(yīng)放冰塊降溫  2、試劑盒未充分平衡  試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡 至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫（約25℃）。 3、培養(yǎng)箱溫度不足37℃ 注意培養(yǎng)箱溫度，放入反應(yīng)板后盡量減少開啟次數(shù)以 免影響溫度恒定，非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意 4、保溫時(shí)間不足  校正定時(shí)鐘準(zhǔn)確定時(shí)  5、洗滌時(shí)沖擊力太大、浸泡時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、洗滌次數(shù)增加  按說(shuō)明書要求保留洗滌時(shí)間，準(zhǔn)確記住洗滌次數(shù) 6、移液器吸液量不足，吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔 校正移液器，吸嘴要配套，裝吸嘴時(shí)要緊密，吸嘴內(nèi)壁要清潔，一次性使用 7、蒸餾水水質(zhì)有問(wèn)題 使用新鮮合格的蒸餾水 8、底物作用時(shí)間不足  準(zhǔn)確定時(shí)  背景深，全部呈有色,  1、洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標(biāo)記物殘留  濃縮洗液準(zhǔn)確配制；10倍濃縮洗滌液如有結(jié)晶則應(yīng) 讓結(jié)晶于室溫全部溶解后再量取稀釋；充分洗滌，*拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應(yīng)棄去不用，不要反復(fù)使用，否則易造成污染  2、樣品污染 樣品應(yīng)新鮮采集，或低溫保存，防止污染  3 、培養(yǎng)箱溫度超過(guò)37℃或反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 調(diào)整培養(yǎng)箱溫度，準(zhǔn)確定時(shí) 4、吸嘴重復(fù)使用，未洗凈或消毒不* 吸嘴盡可能一次性使用 5、蒸餾水被污染 使用新鮮蒸餾水 6、酶等試劑混用  不同批號(hào)試劑勿混用  7、一次實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本量過(guò)多，加樣時(shí)間太長(zhǎng)，導(dǎo)致實(shí)際反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)  合理安排實(shí)驗(yàn)，避免幾塊酶標(biāo)板同時(shí)加樣  重復(fù)性不佳  1、樣品數(shù)量多少不一，加樣時(shí)間有長(zhǎng)有短 重復(fù)某一樣品時(shí)，加樣時(shí)間盡可能與*次接近  2、保溫時(shí)間不一致，洗滌條件不一致，操作人員不一致  重復(fù)測(cè)定標(biāo)本，操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致，以排除這些因素造成的不一致的可能性  3、加樣量不一致  樣品稀釋前應(yīng)充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴  出現(xiàn)白板，陽(yáng)性對(duì)照不顯色  顯色液變質(zhì)  更換新的顯色液  洗滌液配制有誤 請(qǐng)按說(shuō)明書所示稀釋倍數(shù)配制  未加酶結(jié)合物而認(rèn)為已加入 注意不要漏加  終止液誤作洗滌液稀釋或當(dāng)?shù)孜镆菏褂? 每次加液前均應(yīng)看清標(biāo)簽