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分析小鼠elisa試劑盒實驗是出現(xiàn)的問題及解決方法
點擊次數(shù):941 更新時間:2017-05-23

一、小鼠elisa試劑盒顯色淡,靈敏度偏低
1、試劑盒在運輸途中時間太長,溫度太高;所以盡量縮短運輸時間,夏季應(yīng)放冰塊降溫
2、試劑盒未充分平衡;所以試劑盒從2~8℃冰箱取出后打開盒蓋,于室溫平衡至少20分鐘,確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)。
3、培養(yǎng)箱溫度不足37℃,應(yīng)注意培養(yǎng)箱溫度,放入反應(yīng)板后盡量減少開啟次數(shù)以免影響溫度恒定,非隔水式培養(yǎng)箱尤其應(yīng)注意。
4、保溫時間不足;所以做實驗時一定注意時間的重要性,如果怕忘了時間,可以校正定時鐘準確定時。
5、洗滌時沖擊力太大、浸泡時間過長、洗滌次數(shù)增加;按說明書要求保留洗滌時間,準確記住洗滌次數(shù)
6、移液器吸液量不足,吸嘴內(nèi)壁掛水太多或內(nèi)壁不清潔;所以保證校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密,吸嘴內(nèi)壁要清潔,一次性使用。
7、蒸餾水水質(zhì)有問題,要使用新鮮合格的蒸餾水。
二、重復(fù)性較差
 1、樣品數(shù)量多少不一,加樣時間有長有短;所以重復(fù)某一樣品時,加樣時間盡可能與*次接近。
 2、保溫時間不一致,洗滌條件不一致,操作人員不一致;重復(fù)測定標本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性。
 3、加樣量不一致;樣品稀釋前應(yīng)充分混勻,盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴。
三、假陽性結(jié)果和假陰性結(jié)果
1、小鼠elisa試劑盒標本的采集與保存
1.1當標本采集保存不當產(chǎn)生溶血時,紅細胞中的血紅蛋白釋放到血清中,血紅蛋白具有過氧化物酶的性質(zhì),其通過吸附或“PP效應(yīng)”(蛋白質(zhì)間相互吸附的現(xiàn)象)結(jié)合后,可催化A、B液顯色而造成假陽性ELISA試劑盒
1.2標本采集保存不當致細菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,會產(chǎn)生假陽性反應(yīng);標本在冰箱中保存時間過長導(dǎo)致血清IgG聚合,易使間接法的試驗本底加深。因此,標本宜在新鮮時檢測。
1.3反復(fù)凍融血清會使抗體效價跌落,所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測,宜少量分裝凍存。
2、加樣
2.1如果 樣品稀釋液少加或血清多加,都會引起本底增高。對于間接法來說,受上述兩個因素影響更大。因為血清中受檢的特異性IgG只占IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強,非特異性IgG可直接吸附到固相載體上,有時也可吸附到包被抗原的表面。這些非特異性的IgG均可以和酶標二抗發(fā)生反應(yīng)而造成較高陰性本底或假陽性。如果加入的血清過多,高于規(guī)定的稀釋倍數(shù),極易造成高值陰性。反之,造成假陰性。
2.2  如果加入的酶結(jié)合物過多或加在較高的孔壁上或孔口,也會引起本底升高或假陽性。
2.3如果血液未開始凝固或凝固不*時就強行離心分離血清,此時的血清中仍留部分纖維蛋白原,在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊,易造成假陽性結(jié)果。
3.  溫育
3.1  由于ELISA試驗在一定溫度下的反應(yīng)時間并不是反應(yīng)的終點,溫育時間過短、溫度過低,易致顯色不全;溫育時間過長、溫度過高,易致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,難以清洗*,產(chǎn)生陰性高值或假陽性反應(yīng)。因此,要嚴格按規(guī)定的溫度和溫育時間進行。
3.2  由于水浴較難將溫度控制在穩(wěn)定的范圍,因此我們每次試驗時應(yīng)認真觀察水浴箱的溫度,盡量少開啟水浴箱門,嚴格控制水浴的溫度為37±0.5。同時,微孔板不可重疊放置,以保證傳熱均勻,各板的溫度都能迅速達到平衡。
3.3  由于試劑盒通常設(shè)定的反應(yīng)溫度為37度,在這個溫度下溫育一定時間,蒸發(fā)的水分會很多,對于整個反應(yīng)體系來講,各種反應(yīng)物的濃度會不斷地增加,這樣必會導(dǎo)致反應(yīng)zui后的值升高。因此溫育時應(yīng)貼上封板膠。
4.  洗板
洗板在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,但卻是決定試驗成敗的關(guān)鍵。ELISA就是靠洗板來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的,通過洗板以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,而在洗板時應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。在ELISA操作中,洗滌是zui主要的關(guān)鍵技術(shù),應(yīng)嚴格按要求洗滌。洗板如不*,有酶結(jié)合物的非特異性吸附,將使空白值升高。另外,在間接法中如血清標本內(nèi)的非特異性IgG吸附在固相上而未被洗凈,也將與酶標記抗體作用而產(chǎn)生干擾。ELISA試劑盒
4.1  各的洗液是根據(jù)各自試劑的條件配制的,因此采用不配套的洗液常會得到不正常的反應(yīng)結(jié)果,包括本底升高,所以不同的洗液不應(yīng)混用。
4.2  洗液應(yīng)按規(guī)定的倍數(shù)稀釋使用。試劑盒提供的洗液是濃縮的,過多稀釋洗液,會影響洗液的效果,而使反應(yīng)的本底升高。反之造成假陰性。
4.3  小鼠elisa試劑盒稀釋洗液的水應(yīng)該是新鮮的蒸餾水,電導(dǎo)率小于1.5us/cm。如果水中含有過多的鈣、鎂離子,這些離子會占用表面活性劑,使試驗本底增高。
 

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