寨卡病毒PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)常見問(wèn)題原因 1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因： 1) RNA模板質(zhì)量低 2) 對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高 3)反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足 4)同位素磷32過(guò)期 5)反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)超過(guò)50μl 2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺 1)zui常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系 3) 與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān) 4) 建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA 5) 第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10 6) 建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。 7) 目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決： a. 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。 b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。 3. 產(chǎn)生非特異性條帶 1)用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。 2)在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。 3)由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。 4. 產(chǎn)生彌散（smear）條帶 1)在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過(guò)高 2)減少引物的用量 3)優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù) 4)在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。 5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶 1)大多數(shù)情況下是由于退火溫度過(guò)低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的 2)對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10（或1:100-1:200） 6. 在無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果詳細(xì)解析關(guān)于Elisa試劑盒的儲(chǔ)存于有效期多久
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