班氏絲蟲PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)常見問題的常見原因 1. cDNA產(chǎn)量的很低可能的原因： 1) RNA模板質(zhì)量低 2) 對(duì)mRNA濃度估計(jì)過(guò)高 3)反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足 4)同位素磷32過(guò)期 5)反應(yīng)體積過(guò)大，不應(yīng)超過(guò)50μl 2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺 1)常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系 3) 與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān) 4) 建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA 5) 第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過(guò)1/10 6) 建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物（GSP）用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火；或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。 7) 目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決： a. 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。 b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。 |
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