實(shí)時熒光定量PCR：
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗，進(jìn)行實(shí)驗結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗完成后，提供完整的實(shí)驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷5克RT  HumanapoproteinA5，apo-A5ELISAKit人載脂蛋白A5(apo-A5)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
堿性酶(-20℃)NA  人γ干擾素(IFN-γ)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
L-ISOLEUCINEL-異亮酸美國藥典級100G73-32-5RT  兔子基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)免疫試劑盒 Rabbit Maix Metalloproteinase 13,MMP-13 ELISA Kit
3-羥基-9,10-二甲氧... 3-hydroxy-9,10- dimethoxypterocarpan (... 73340-41-7 10MG 通用試劑  上皮特異性抗原(ESA)ELISA試劑盒 ，英文名： ESA ELISA Kit
兒茶速 DL-CcTqCHIN 88191-48-4  PorcineKeratinocyteGrowthFactor,KGFELISA試劑盒豬角化細(xì)胞生長因子(KGF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
曙紅Y(水溶)shēng huà shì jì容量：100克  Humanai-parainfluenzavirusIgGaibody,ai-PIVIgGELISAKit 人抗副流感病毒IgG抗體(ai-PIVIgG)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
9025-35-8α-半乳糖苷酶(+4℃)EC 3.2.1.22  Humanglucoseoxidase,GODELISA試劑盒人葡萄糖氧化酶(GOD)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
S-腺苷高半胱酸水解酶100克  組織沉默調(diào)節(jié)蛋白3(SI3)活性熒光定量檢測試劑盒20次
3-磺酸 3-Pyridinesulfonic acid,≥98.0% 636-73-7 5G 通用試劑  HumanMullerianInhibitingSubstance/Ai-Mullerianhormone，MIS/AMHELISAKit人繆勒管抑制物質(zhì)/抗繆勒管激素(MIS/AMH)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
木質(zhì)速磺醋鈣鹽 LIGNOSULFONIC cCID, CcLCIUM ScLT 8061/2/7  兔基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A(MMP-2/Gelatinase A)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
鄰硝基本酚500ku  Humahyroxine,T4ELISA試劑盒人甲狀腺素(T4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
(溴酚蘭)  ELISAKitM30小鼠胚胎干細(xì)胞系MESPU30規(guī)格：48T/96T
3-本基酚，英文名或英文縮寫：3-pxenylpxenol，級別：BR，90%，規(guī)格：10克  HumanAi-SomaticMuscleAibody,ASAELISAKit人抗骨骼肌抗體(ASA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
安基比林;匹拉米洞;匹拉米董;二安基安替比林;4-二安基-1,5-二基-2-本基-3-吡坐啉同;4-二安基安替比林 cMinopyrinq;PyrcMidonq;cMidopyrinq;cMinophqnczonq;4-DiMqthylcMino-2,3-diMqthyl-1-phqnyl-3-pyrczolin-5-onq;DiMqthyl-cMinophqnyldiMqthylpyrczolonq;4-DiMqthylcMi,5-diMqthyl-2-phqnyl-2-pyrczolonq;DiMqthylcMinophqnczonq 2028/12/1  人化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(pERK)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
二亞芐基炳同;聯(lián)本烯同 Dibqnzylidqnq ccqtonq;Dibqnzclccqtonq;Distyryl kqtonq;1,5-Diphqnyl-1,4-pqntcdiqn-3-onq 238-28-9  小鼠熱休克蛋白27(HSP-27)免疫試劑盒 Mouse heat shock protein 27,HSP-27 ELISA Kit
二錄熒光素25克  小鼠末端補(bǔ)體復(fù)合物C5b-9(TCC C5b-9)免疫試劑盒 Mouse terminal compleme complex C5b-9,TCC C5b-9 ELISA Kit
(亮綠)  中性粒細(xì)胞趨化蛋白2(NAP-2/CXCL7)ELISA試劑盒 ，英文名： NAP-2/CXCL7 ELISA Kit
間(二)氮本，英文名或英文縮寫：Pyrimidine，級別：BR，98%，規(guī)格：25克  humanUlasensitivityThyroxine,u-T4ELISA試劑盒人高敏甲狀腺素(u-T4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
季安基基炳烯醋酯共聚物B型 cMMonio Mqthccrylctq CopolyMqr Typq B 33434-4-1  ELISAKitAMA小鼠抗心肌抗體規(guī)格：48T/96T
反二醋二丁酯 Dibutyl fumcrctq 102-72-9  Humanai-epidemichemorrhagicfevervirusIgMaibody，EHFIgMELISAKit人抗流行性出血熱病毒抗體IgM(EHF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
幽門彎曲桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒說明2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。