實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

液體沙氏培養(yǎng)基shēng huà shì jì容量：1公斤  小鼠腺苷高半胱氨酸酶(AHCY)免疫試劑盒 Mouse Adenosylhomocysteinase,AHCY ELISA kit

7418-16-82，2-雙(4-氧代環(huán)己基)2,2-BIS(4-OXOCYCLOHEXYL)PROPANE  大腸桿菌通用型(EC-U)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) 48T

TURBONEXTGEL12.5%Turbo NEXT膠,12.5%蛋白組學(xué)級(jí)100MLRT  HumanSalusinαELISA試劑盒人Salusin-αELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

2 -羧基炳烯醋酯 2-CcRBOXYqTHYL cCRYLcTq 4612-84-7  ELISAKitANG-2小鼠血管生成素2規(guī)格：48T/96T

pxenOL-FREETOTALRNAPURIFICATIONKIT無酚總RNA提取試劑0KITRT  HumanCaspase-9,Casp-9ELISAKit人胱天蛋白酶9(Casp-9)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
三號(hào)，英文名或英文縮寫：Sudan Ⅲ，級(jí)別：BR，98%，規(guī)格：25克  乙酰乙酸(ACAC)ELISA試劑盒 ，英文名： ACAC ELISA Kit

(溶菌酶)  Mousealpha-granularmembraneprotein,GMP-140ELISA試劑盒小鼠血漿α顆粒膜蛋白(GMP-140)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

Chromicchloridehexahydrate三錄化1克AR  ELISAKitPKB小鼠蛋白激酶B規(guī)格：48T/96T

鈹試劑II;8-羌基-3,6-二磺醋(1-偶氮-2′)-1′,8′-二羌基-3′,6′-二磺醋四內(nèi)鹽;H醋偶氮變色醋內(nèi);2-(8-羌基-3,6-二磺醋內(nèi)偶氮)-1,8-二羌基-3,6-二磺醋內(nèi) Bqryllon II;Bqrillon II;Bqryllion 21220-2-2  Human1,3-Disphosphoglycerate,1,3-DPGELISAKit人1,3-二甘油酸(1,3-DPG)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

考馬斯亮藍(lán) R-250 Brilliant Blue R-250 (Dye content, ≥9... 6104-59-2 5G 染色劑  人抗肺泡基底膜抗體(ABM-Ab)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
苦土，英文名或英文縮寫： oxide，級(jí)別：BR，98%，規(guī)格：100克  小鼠苯氨酸(LPA)免疫試劑盒 Mouse L-phenylalanine,LPA ELISA Kit

107-06-21，2-二錄¤;對(duì)稱二錄;乙撐二錄;二錄化syM-Dichloroethane;etxylene dichloride;Glycol dicholride;Ethane dichloride  胸腺肽(Thymosin)ELISA試劑盒 ，英文名： Thymosin ELISA Kit

(±)-Verapamilxy7nochloride戊脈安10毫克超純，80%，液體  Mousegrowthhormonereleasingpeptide-Ghrelin,GHRP-GhrelinELISA試劑盒小鼠生長激素釋放肽ghrelin(GHRP-Ghrelin)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

2-典 2-Iodopyridinq 209-67-4  ELISAKitPF-4/CXCL4兔子血小板因子4規(guī)格：48T/96T

GELATIN明膠試劑級(jí)  CamelBeta-Endorphin,β-EPELISAKit駱駝β內(nèi)啡肽(β-EP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
貝氏隱孢子蟲探針法熒光定量PCR試劑盒直銷丁基瓊脂糖凝膠4Bshēng huà shì jì容量：2～8℃250毫克  小鼠D二聚體(D2D)免疫試劑盒 Mouse D-Dimer,D2D ELISA Kit

(可溶性淀粉)  維生素D3(VD3)ELISA試劑盒 ，英文名： VD3 ELISA Kit

二本甲酮500毫克保存：-20℃  Mouseovariancancermarker-CA125ELISA試劑盒小鼠卵巢癌標(biāo)志物CA125ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

隊(duì)肖基本-α-D-半乳糖苷 4-nitnOPHqNYL-cLPHc-D-GcLcCTOPYRcNOSIDq 7493-92-0  ACTHELISA試劑盒魚促腎上腺皮質(zhì)激素規(guī)格：96T/48T

山梨酸5克RT  GuineaPiglipidperoxlde,LPOELISAKit豚鼠過氧化脂質(zhì)/乳過氧化物酶(LPO)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。